肠道-脑轴新突破！Nat Methods：诱导多能干细胞变身「内脏感觉神经节类器官」，揭示神经疾病奥秘

在神经科学领域，肠道-脑轴（gut-brain axis，肠道与大脑之间的相互作用）的研究越来越受到重视。肠道微生物组在多种神经疾病患者中发生了变化，而调控这些微生物可以减轻小鼠模型中的神经疾病症状。尽管免疫系统和肠道-血液-脑轴（gut-blood-brain axis）的作用受到了广泛关注，但迷走神经（vagus nerve）——这条连接大脑和肠道的重要通道——的作用也不容忽视。

与此同时，随着干细胞技术的进步，科学家们已经能够从诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）中产生各种细胞和类器官（organoids，实验室中培养的微型器官）。然而，生成内脏感觉神经元（visceral sensory neurons, VSNs）的方案尚未完善。这些神经元对于理解肠道-脑轴在神经疾病中的作用可能具有重要意义。

近日，韩国首尔大学的Inhee Mook-Jung研究团队在《自然·方法》（Nature Methods）上发表了一篇题为“Differentiating Visceral Sensory Ganglion Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells”的研究论文。该研究成功创建了一种从iPSCs分化出内脏感觉神经节类器官（visceral sensory ganglion organoids, VSGOs）的方法。

分化过程及验证

研究人员通过一系列特定的方法和调控，成功地将iPSCs分化为内脏感觉神经节类器官。在这个过程中，他们使用了定量PCR和免疫染色技术进行验证。例如，PAX2基因在分化过程中表达量较高，而TFAP2A和PAX8基因的表达量有所降低，这为分化过程的准确性提供了有力的证据。

图1：从iPS细胞中分化OEPD和EpP

VSGO和i-VSN的分化及验证

以早期阶段的细胞为基础，通过添加多种生长因子，研究团队成功分化出了VSGO和内脏感觉神经元（i-VSNs）。免疫染色结果显示，VSGO能够表达多种典型的神经节标记物，如PHOX2B和PIEZO1。此外，钙成像和膜片钳分析表明，VSGO具备功能性，并且包含多种对不同化学物质有反应的i-VSN群体。

单细胞RNA分析结果

通过对i-VSNs和VSGO进行单细胞RNA测序并整合分析，研究团队确定了多种细胞类型，包括VSNs、施万样细胞（Schwann-like cells, SCs）、卫星胶质样细胞（satellite glia-like cells, SGCs）以及EpP样细胞（EpP-like cells, EpPLs）。这些细胞类型各自具有独特的标记基因表达模式，为深入了解细胞的组成和特性提供了基础。

图2：VSGO单细胞RNA分析

发育轨迹分析

通过轨迹分析技术，研究团队揭示了VSGO分化的发育途径。他们发现了多种祖细胞类型，如边境未决定祖细胞（borderline undetermined progenitors, BLUPs），以及不同的分化轨迹，如BLUPs-NEpP2和BLUPs-OEPD-NEpP1等。这些发现确定了相关的关键驱动基因，对于理解细胞分化的机制和调控具有重要意义。

亚簇分析

亚簇分析显示，VSNs具有明显的异质性。不同亚簇能够表达不同的神经肽受体和神经递质。例如，某些亚簇表达P2RX家族受体，并且在神经递质分泌方面，不同亚簇对血清素、去甲肾上腺素等的分泌情况各不相同。这体现了VSNs在功能和分子表达上的多样性。

轴-芯片模型结果

研究团队成功设计并构建了微流控芯片，将VSGO与人结肠类器官（human colon organoids, HCOs）连接起来，形成了3D轴-芯片模型。通过填充细胞外基质，有效减少了分子扩散。免疫染色观察到芯片上的神经连接，并利用逆行跨突触伪狂犬病毒验证了VSGO和HCOs之间的直接连接。

图3：使用微流控芯片建立连接VSGO和HCO的3D轴-芯片

功能连接验证

钙成像结果显示，VSN在与HCO连接时对葡萄糖和胆汁酸会产生特定的反应，从而验证了两者之间存在功能连接。对轴-芯片上的类器官进行单细胞分析，确定了HCO和VSN的不同细胞簇以及相关标记基因表达情况，并且发现这种连接会导致转录组发生改变，进一步说明了两者之间的紧密联系和相互影响。

在AD研究中的应用结果

在轴-芯片模型中研究Aβ（淀粉样蛋白β）和tau（tau蛋白）传播时，研究团队发现VSNs可能是这些病理蛋白传播的潜在介质。APOE4（载脂蛋白E4）和LRP1（低密度脂蛋白受体相关蛋白1）对传播过程产生了影响。通过比较不同iPSCs来源的VSNs，发现APOE4会影响亚簇的分布及基因表达。对内脏运动神经元（visceral motor neurons, VMNs）的研究表明，其在Aβ和tau传播过程中的作用小于VSNs。应用患者来源的iPSCs构建轴-芯片模型，发现Aβ和tau的传播与临床数据之间存在相关性，为研究AD的发病机制和相关治疗提供了新的视角和依据。

图4：患者来源的内脏感觉神经节类器官（VSGO）的Aβ和tau传播测定

这项研究成功建立了从iPSCs分化内脏感觉神经节类器官的方法，并通过多维度研究验证了其分化过程及特性。构建的轴-芯片模型在神经疾病研究中显示出VSNs可能是肠道-脑轴中病理蛋白传播的潜在介质，受APOE4和LRP1影响，且与临床数据相关。这项研究为神经疾病研究提供了新的模型和思路，有助于深入理解肠道-神经-脑轴在神经疾病中的作用机制，对未来相关疾病的治疗和研究具有重要意义。（生物谷Bioon.com）

参考文献：

Ahn, K., Park, HS., Choi, S. et al. Differentiating visceral sensory ganglion organoids from induced pluripotent stem cells. Nat Methods (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02455-8